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    出血性大腸菌及檢驗

    放大字體  縮小字體 發布日期:2010-05-11  瀏覽次數:2123
    核心提示:一、概況  腸出血性大腸桿菌(EHEC)是能引起人的出血性腹瀉和腸炎的一群大腸埃希氏菌。以O157:H7血清型為代表菌株。 

    一、概況

      腸出血性大腸桿菌(EHEC)是能引起人的出血性腹瀉和腸炎的一群大腸埃希氏菌。以O157:H7血清型為代表菌株。

      腸出血性大腸桿菌感染可引起輕度腹瀉、出血性結腸炎(HC)、溶血性尿毒綜合癥(HUS),血栓性血小板減少性紫癜(TTP)等。其中HUS病程兇險,易造成急性腎衰竭乃至死亡。

      1982年美國首次報道了由EHEC O157:H7引起的出血性腸炎暴發。此后,世界各地陸續報道了該菌引起的感染,并有上升趨勢。1996年在日本發生的EHEC O157:H7的暴發流行,引起出血性腹瀉,先后波及30多個都、府、縣,感染近萬人,并造成12人死亡,引起了全世界的關注。此外,美國、加拿大、瑞典、澳大利亞、英國的蘇格蘭和威爾士等國家和地區也相繼報道了EHEC的散發性感染和暴發流行。日本、加拿大及瑞士等國已將EHEC O157:H7列為必須報告的傳染病,予以高度重視。我國于1988年首次分離到EHEC O157:H7,從已有的流行病調查資料來看,我國亦存在EHEC的散發病例,但尚未有暴發流行的報道。

    二、流行病學

      EHEC O157:H7引起的感染有明顯的季節性,多發生于夏秋兩季,7-8月為發病高峰。在地區分布上,多發生于發達國家,主要以散發性感染為主。在年齡分布上,兒童與老年人的發病率明顯高于其他年齡組,且并發HUS和TTP的機率較高。最易分離到 O157:H7的年齡為5-9歲(0.9%)和50-59歲(0.89%)。農場動物,尤其是反芻動物,構成EHEC O157:H7在世界范圍內的主要貯存宿主。O157:H7在牛中的流行報告范圍為0.1-16%;羊、豬、雞、馬、鹿、鴿子、海鷗等動物均可能為EHEC的攜帶者。EHEC的感染可形成直接傳播(動物→人,人→人),也可以通過間接傳播(食物、水源→人)。食源性的EHEC感染中,牛肉、生奶、雞肉及其制品,蔬菜、水果及其制品等均可能受其污染。其中, 牛肉是最主要的傳播載體。

      EHEC O157:H7的感染劑量極低。潛伏期為3-10天,病程2-9天。通常是突然發生劇烈腹痛和水樣腹瀉,數天后出現出血性腹瀉,可發熱或不發熱。部分患者可發展為HUS、TTP等, 嚴重者可導致死亡。

    三、生物學特征

      EHEC O157:H7屬于腸桿菌科埃希氏菌屬。革蘭氏染色陰性,無芽胞,有鞭毛,動力試驗呈陽性。其鞭毛抗原可丟失,動力試驗陰性,即O157:NM。EHEC O157:H7具有較強的耐酸性,pH2.5-3.0,37℃可耐受5小時;耐低溫,能在冰箱內長期生存;在自然界的水中可存活數周至數月;不耐熱,75℃ 1分鐘即被滅活;對氯敏感,被1mg/L的余氯濃度殺滅。EHEC 的最適生長溫度為33-42℃,37℃繁殖迅速,44-45℃生長不良,45.5℃停止生長。

      EHEC O157:H7除不發酵或遲緩發酵山梨醇外,其他常見的生化特征與大腸埃希氏菌 基本相似,但也有某些生化反應不完全一致,具有鑒別意義(詳見表2)。EHEC O157:H7雖然有uidA基因,但其編碼的β-葡萄糖醛酸酶無活性,不能分解4-甲基傘形酮-β-D-葡萄糖醛酸苷(MUG)產生熒光,即MUG陰性。

      EHEC除其代表菌株O157:H7外,還包括O157:NM、O26:H11、O111:H8、O125:NM、O121:H19、O45:H2、O4:NM、O145:NM、O5:NM、O91:H21、O103:H2、O113:H2等血清型的部分菌株。血清學鑒定包括O抗原和H抗原的鑒定。前者可使用玻片凝集試驗或膠乳凝集試驗;后者則應先進行動力試驗,動力活潑者再進行玻片和試管凝集試驗。

      EHEC O157:H7的另一個顯著特征是可產生大量的Vero毒素(VT),也稱作類志賀氏毒素(SLT),是EHEC的主要致病因子。Vero毒素按免疫原性等方面的不同可分為VT1和VT2。該毒素有一個A亞單位和5~6個B亞單位組成。B亞單位與宿主腸壁細胞糖脂受體結合,具有毒素活性的A亞單位進入細胞,改變60s核糖體的組分,干擾蛋白質的合成。編碼VT的基因位于噬菌體上,可缺失而不產生VT。

    四、EHEC O157:H7的檢驗

    1、培養基制備:

      改良EC新生霉素增菌肉湯 (mEC)

      EC肉湯滅菌后添加20mg/mL過濾除菌的新生霉素,使終濃度為20μg/mL。

      改良山梨醇麥康凱瓊脂(TC-SMAC)

      山梨醇麥康凱瓊脂加入過濾除菌的1%亞碲酸鉀溶液,使終濃度2.5mg/L,頭孢克污,使終濃度為0.05mg/L。

      MUG-LST肉湯

      LST肉湯中添加4-甲基傘形酮-β-D-葡萄糖醛酸苷(MUG),使終濃度為0.1g/L。

    2、增菌培養

      秤取25克樣品放入225mL mEC中,均質。于41±1℃培養18-24小時。

    3、分離

      將mEC肉湯培養物10倍遞增稀釋。從10-4,10-5,10-6稀釋度,各取0.1mL涂布于TC-SMAC平板。于36±1℃培養18~24小時。可疑 EHEC O157:H7菌落扁平,透明或半透明,邊緣光滑,呈淡褐色中心,直徑約2mm。

    4、鑒定

      挑取TC-SMAC上的可疑菌落,接種MUG-LST,于36±1℃培養18~24小時,出現產氣,且無熒光者,分離到普通營養瓊脂。

      對純菌落用EHEC O157:H7標準血清或膠乳凝集試劑作凝集試驗,必要時進行生化試驗。

      在檢測過程中,也可以在選擇性增菌后,取出5mL增菌液,經100℃水浴15分鐘滅活后,供自動酶聯熒光免疫測試(VIDAS),迅速獲得初步結果,陽性反應者需作進一步證實。

      EHEC O157:H7檢驗程序圖解

    檢樣25g

          mEC225mL → VIDAS快速篩選

      ↓41±1℃,18-24h

    10-4,10-5,10-6稀釋度涂布TC-SMAC

    ↓36±1℃,18-24h

    挑取5-10個可疑菌落接種MUG-LST

    ↓36±1℃,18-24h

    MUG陰性培養物轉種普通營養瓊脂

    ↓     ↓

    生化反應鑒定    血清凝集鑒定

           或

             膠乳凝集試驗

      用上述方法在樣品中分離獲得的純菌落,經抗E.coli O157:H7標準血清或EHEC O157:H7膠乳凝集測試為陽性者,報告檢出腸出血性大腸桿菌O157:H7。

      如需要進一步檢測Vero毒素基因的存在,可通過接種Vero細胞或Hela細胞,觀察細胞病變進行判定,或可使用基因探針檢測和聚合酶鏈反應(PCR)檢測法。(參見FDA細菌分析手冊第8版)

    表1:EHEC O157:H7部分生化反應特性

    靛基質(吲哚)試驗

    陽性

    MR-VP試驗

    MR陽性 VP陰性

    枸櫞酸鹽利用試驗

    陰性

    氧化酶試驗

    陰性

    三糖鐵瓊脂

    底及斜面黃色,H2S-

    纖維二糖發酵

    陰性

    山梨醇發酵

    陰性或遲緩發酵

    賴氨酸脫羧酶

    陽性(紫色)

    鳥氨酸脫羧酶

    陽性(紫色)

    棉子糖發酵

    陽性

    衛矛醇發酵

    陽性

    西蒙氏檸檬酸鹽

    陰性

    鼠李糖發酵

    陽性

    MUG試驗

    陰性

    動力試驗

    有動力或無動力

     

    表2: EHEC O157:H7與大腸埃希氏菌有鑒別意義的生化特性

    試驗項目

    E.coliO157:H7

    (174株)%

    大腸埃希氏菌

    (974株)%

    (1887株)%

    MUG

    0

    96

    NT

    山梨醇

    0

    95

    80

    棉子糖

    100

    20

    49

    衛矛醇

    100

    50

    49

    賴氨酸

    100

    92

    81

    鳥氨酸

    100

    74

    58

     

    [注] NT為未檢測,表內數字為陽性率。

    五、控制

      適宜的蒸煮,適當的儲存溫度,個人衛生教育,防止糞便污染動物胴體是控制出血性大腸桿菌污染的主要措施。

    編輯:foodyy

     
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